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高效液相色譜法檢測(cè)海水養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類藥物殘留

　　摘要：建立了一種養(yǎng)殖海水中諾氟沙星、環(huán)丙沙星爭(zhēng)恩諾沙星3種喹諾酮類抗生素殘留量的高效液相色譜一熒光測(cè)定方法。水樣經(jīng)稀鹽酸調(diào)PH后經(jīng)HLB固相萃取柱富集、凈化，用外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星檢出限分別是2、1和1 gg/L，定量限分別是6.6、3.3和3.3 ug/L，添加濃度為10、20和50 ug/L時(shí)，3種物質(zhì)的回收率為71.9%～85.3%，批內(nèi)變異系數(shù)≤10%，批問變異系數(shù)≤7%。利用該方法對(duì)黃海沿岸部分養(yǎng)殖場(chǎng)及近岸海水(北起36。40.303 7 N，1210 8.939’E;南至35。39.36’N，119。52.433’E)進(jìn)行分析，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的檢出質(zhì)量濃度分別為6.20～982、55.2和11.6～55.4 ug/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，適用于養(yǎng)殖海水中諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢測(cè)。

　　關(guān)鍵詞喹諾酮類抗生素高效液相色譜固相萃取海水

　　喹諾酮類(Quinolones，QNs)抗生素是一族人工合成的新型殺菌性抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性以及毒副作用小的特點(diǎn)，主要用于水生動(dòng)物弧菌病、鏈球菌病、水霉病和寄生性疾病的防治，其中諾氟沙星(Norfloxacin，NF)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)和恩諾沙星(Enrofloxacin，EN)等被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。目前，我國(guó)針對(duì)這類抗生素的研究主要集中于水產(chǎn)品中檢測(cè)技術(shù)和代謝動(dòng)力學(xué)的研究(方星星等2004;錢云云等2007;曲曉榮等2007;王洪艷等2007;何平等2008;李娜等2009)。

　　近年來我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，產(chǎn)量和規(guī)模不斷增加，但由于環(huán)境惡化和養(yǎng)殖模式的改變，水生動(dòng)物疾病頻發(fā)。為了預(yù)防和治療水生動(dòng)物疾病，抗生素被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中。但研究表明，所使用的抗生素僅20%"-30%被魚類吸收，大部分進(jìn)入環(huán)境中(Samuelsen 1989)，而這部分抗生素再次進(jìn)入食物鏈，可能導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中病菌耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致二次污染(Hamscher et a1. 2002)。這不僅影響到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而且還威脅著生態(tài)環(huán)境的安全。因此，需要建立水環(huán)境中這類藥物的檢測(cè)方法。

　　高效液相色譜法測(cè)定海水中環(huán)丙沙星含量的方法，并測(cè)定其衰減度，在O～6 h內(nèi)環(huán)丙沙星衰減很快，但6 h后其濃度基本穩(wěn)定，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星在海水中衰減程度隨鹽度的增加而加快。利用高效液相色譜法分析城市河水中的多種抗生素，水樣由稀鹽酸調(diào)pH至4.2后經(jīng)HLB固相萃取，用內(nèi)標(biāo)法通過HPLC進(jìn)行定量分析。對(duì)海水養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類殘留量的檢測(cè)研究報(bào)道較少。為減少海水養(yǎng)殖環(huán)境中鹽分、浮游生物及微小顆粒對(duì)喹諾酮類測(cè)定存在的干擾，本研究采用固相萃取技術(shù)對(duì)海水中的3種喹諾酮類抗生素進(jìn)行富集和凈化處理，采用高效液相色譜熒光檢測(cè)器測(cè)定，建立了諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星3種喹諾酮類抗生素殘留檢測(cè)方法，并測(cè)試了青島附近黃海海水養(yǎng)殖區(qū)(從36。40.303’N，121。8.939’E至35。39.36 7N，119。52.433 7E)海水中的喹諾酮的含量，為海水中藥物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1海水樣品

　　海水樣品采自黃海近岸海水養(yǎng)殖區(qū)，包括5個(gè)采樣點(diǎn)(圖1)：山東省海陽市大閻家鎮(zhèn)某半滑舌鰨養(yǎng)殖場(chǎng);山東省即墨市鰲山衛(wèi)鎮(zhèn)某大菱鲆養(yǎng)殖場(chǎng);青島市太平角海區(qū);青島市紅島灘涂養(yǎng)殖區(qū);山東省膠南市瑯琊鎮(zhèn)某海參養(yǎng)殖場(chǎng)。分別用玻璃取樣瓶在每個(gè)采樣點(diǎn)采集500 ml表層海水，4℃密封保存，經(jīng)0.45um醋酸纖維濾

　　膜水相濾膜過濾后使用。

　　1.2儀器和試劑

　　海能LC7000型高效液相色譜儀，配LC7070熒光檢測(cè)器;VisiprepTM-DL型固相萃取裝置(Supeleo);漩渦混合器(德國(guó)IKA儀器公司);KQ-600DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Milli—Q超純水器(Milli—pore公司);Laborota400型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Heidoplh公司);PHS-3C精密pH計(jì)(雷磁儀器廠);OasisHLB固相萃取小柱(3 ml/60mg，Waters公司)。

　　標(biāo)準(zhǔn)品和試劑：諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99.8%)、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99.8%)、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99.8%)(美國(guó)Sigma chemical公司);甲醇、乙腈為色譜純;四丁基溴化銨、磷酸為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均來自Milli-Q純水系統(tǒng)。

　　標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 ug/m1)：準(zhǔn)確稱取諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別用乙腈溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，于4℃保存(保存期不超過3個(gè)月)。

　　混標(biāo)使用液：分別取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋成濃度均為1.0ug/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作使用液，

　　4℃保存。

　　0.01 mol/L四丁基溴化銨溶液(0.01 mol/L)：精確稱取3.22 g四丁基溴化銨，用水溶解并定容至1 000ml棕色容量瓶中，用磷酸調(diào)pH至3.1。

　　1.3方法

　　1.3.1提取方法

　　取水樣60 m1，用稀鹽酸調(diào)pH值至4.0，通過HLB固相萃取柱富集、凈化。HLB柱上樣之前依次用3 ml甲醇和3 ml水活化。水樣過柱流速控制在1 ml/min以下。樣品過柱后，先用2 ml水淋洗，減壓抽干后用10ml甲醇洗脫至雞心瓶中，35～40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用1.0 ml流動(dòng)相定容，充分渦旋溶解殘?jiān)�，濾液經(jīng)0.22

　　弘m微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測(cè)定。

　　1.3.2測(cè)試方法

　　色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C/18柱(250 mmX4.6 mm);柱溫：40℃;流動(dòng)相：乙腈+0.01 mol/L四丁基溴化銨(pH 3.1)=5+95(V/V);流速：1.5 ml/min;熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm;進(jìn)樣量：20ul。

　　1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　1.3.3.1標(biāo)準(zhǔn)工作液，

　　準(zhǔn)確量取混標(biāo)使用液，用流動(dòng)相配制成濃度為1、2、5、10、20、50和100/zg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

　　1.3.3.2繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

　　將繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液從低濃度到高濃度依次注入液相色譜儀，按1.3.2方法進(jìn)行分析。每一濃度進(jìn)兩針，按其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

　　1.3.4檢出限和定量限

　　取加標(biāo)水樣按“1.3.1和1.3.2”方法進(jìn)行處理和分析，以3倍信噪比(S/N=3)對(duì)應(yīng)濃度為分析物的最低檢測(cè)濃度，以10倍信噪比(S/N=10)對(duì)應(yīng)濃度為分析物的最低定量濃度。

　　1.3.5 回收率及變異系數(shù)的測(cè)定

　　取空白海水樣品60 m1，添加10、20和50ug/L的混標(biāo)使用液，每個(gè)添加水平設(shè)5個(gè)平行，按“1.3.1和1.3.2”的方法進(jìn)行處理和分析，取峰面積值分別計(jì)算3種喹諾酮類抗生素的含量，以加入量和測(cè)定值之比計(jì)算回收率。按每個(gè)濃度各測(cè)定5個(gè)樣品計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù);每個(gè)濃度各測(cè)3批，計(jì)算批間變異系數(shù)。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　配制濃度為1、2、5、10、20、50和100ug/L 3種喹諾酮類的標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定其峰面積，并做面積與濃度工作曲線(圖2)。結(jié)果表明，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的1～100ug/L濃度與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)參數(shù)見表1。

　　2.2檢出限和定量限

　　以3倍信噪IZ(S/N=3)對(duì)應(yīng)濃度為分析物的最低檢測(cè)濃度，3種喹諾酮類抗生素的最低檢測(cè)限分別為NF 2ug/L，CIP 1ug/L和EN 1ug/L。以10倍信噪比(S/N=10)對(duì)應(yīng)濃度為分析物的最低定量濃度，3種喹諾酮類抗生素的最低定量限分別為NF 6.6ug/L、CIP 3.3ug/L和EN 3.3ug/L。

　　2.3 回收率及變異系數(shù)的測(cè)定

　　取空白海水為試驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定3種喹諾酮類的添加濃度在10～50弘g/L時(shí)的回收率和變異系數(shù)(表2)�；厥章示�71.9%～85.3%之間，批內(nèi)變異系數(shù)均≤10%，批問變異系數(shù)≤7%。

　　2.4實(shí)驗(yàn)色譜圖

　　2.5樣品測(cè)定

　　分析了10份采自不同海域的養(yǎng)殖海水，結(jié)果見表3。譚建華等(2007)利用固相萃取的方法分析了珠江廣州河段的城市河水，檢測(cè)到諾氟沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度范圍為0.197,'一0.510/堅(jiān)g/L，說明人們?nèi)粘Ｉ钪幸灿?種喹諾酮類抗生素;本試驗(yàn)對(duì)黃海沿岸部分養(yǎng)殖場(chǎng)及近岸海水分析，有養(yǎng)殖海水檢測(cè)到3種喹諾酮類抗生素，而近岸海水未檢測(cè)到3種喹諾酮類抗生素。這說明大水域生態(tài)系統(tǒng)由于面積大、范圍廣，更有利于稀釋、降解抗生素。養(yǎng)殖海水中檢出喹諾酮類抗生素的原因可能是：(1)3種喹諾酮類抗生素藥物仍在使用。藥物的不規(guī)范使用是導(dǎo)致水環(huán)境中存在檢出藥物的重要原因(王朋華等2008);(2)殘留在海水中的未代謝藥物。水生動(dòng)物用藥后，藥物以原形或其代謝物的形式通過糞便和尿液排到體外，繼而對(duì)海水造成污染;(3)殘留在海底底泥中未代謝的藥物。Kiimmerer(2001)報(bào)道環(huán)丙沙星進(jìn)入水體后，會(huì)被沉積物吸附，有65%進(jìn)入到污泥中。

　　3 結(jié)論

　　本研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)海水中喹諾酮類抗生素的分析方法。該方法對(duì)海水樣品進(jìn)行60～150倍的濃縮，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星檢出限分別是2、1和1 ug/L，定量限分別是6.6、3.3和3.3ug/L，添加濃度為l0、20和50 ug/L時(shí)的回收率為71.9%～85.3%，批內(nèi)變異系數(shù)≤10%，批間變異系數(shù)≤7%。該方法凈化效果好、操作簡(jiǎn)便、精確度高，且重復(fù)性好。

高效液相色譜法檢測(cè)海水養(yǎng)殖環(huán)境中喹諾酮類藥物殘留

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