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高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法，同時測定四君子丸中的5 種有效成分

　　四君子丸為四君子湯的現(xiàn)代劑型，由黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草組成，被《中華人民共和國藥典》( 2005 版) 收載[1]�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，四君子湯可增強機體的抵抗力，調(diào)節(jié)機體各方面的功能，對垂體、心血管功能、消化道運動功能和免疫功能有明顯的改善作用[2]。四君子丸含有黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等主要活性成分[3 - 7]。對于黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的定量分析方法，已有的文獻(xiàn)報道均是對其中的一種或兩種成分進行測定[8 - 14]，尚未見對上述5 種活性成分同時測定的報道。按照藥典[1]的規(guī)定，對四君子丸的鑒定僅依靠薄層色譜法進行，結(jié)果比較粗放。本文對四君子丸中的上述5種活性成分同時進行了含量測定，可為四君子丸的全面質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

　　1 實驗部分

　　1. 1 儀器與試藥

　　LC7000高效液相色譜儀(海能儀器) ，包括LC7011輸液泵，LC7070蒸發(fā)光散射檢測器; HanonClatity色譜工作站。HIQ SIL C18V 色譜柱( 250 mm× 4. 6 mm，5 μm) 。甲醇( 色譜純) ，二次蒸餾水( 自制) ，冰醋酸( 分析純) ; 黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 、茯苓酸和甘草酸銨對照品; 黨參、白術(shù)、茯苓、甘草均購于濟南漱玉平民藥店; 用于方法優(yōu)化的四君子丸樣品為自制，每丸平均質(zhì)量為3. 0 g，符合中國藥典對丸劑的各項規(guī)定要求。測定的四君子丸實際樣品分別為5 個藥品生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品。

　　1. 2 對照品溶液的制備

　　分別精密稱取黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品適量，分別配制質(zhì)量濃度為6. 03，3. 78，12. 24，3. 62，7. 80 g /L 的儲備液。將上述5 種儲備液各取500 μL 混合、搖勻，即得含黨參炔苷1. 21 g /L、茯苓酸0. 76 g /L、甘草酸2. 45 g /L、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 0. 72 g /L 和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 1. 56g /L 的混合對照品儲備液。

　　1. 3 供試品溶液的制備

　　取丸劑研碎，并稱取1. 00 g，加入乙醇15 mL，超聲提取30 min，過濾。濾渣再重復(fù)提取2 次。合并提取液并濃縮，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用乙醇定容，搖勻; 取其中1 mL 于16 000 r /min 速率下離心10 min，上清液作為供試品溶液。

　　1. 4 色譜條件

　　色譜柱: HIQ SIL C18V 柱( 250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ; 流動相: 0. 5%冰乙酸水溶液為流動相A，甲醇為流動相B; 梯度洗脫程序: 0 - 40 min，80%A -20%A; 流速: 1. 0 mL /min; 進樣量: 10 μL; 漂移管溫度: 55 ℃; 噴霧器加熱級別: 60%; 載氣: 氮氣，壓力0. 2 MPa; 信號增益值: 50。

　　2 結(jié)果與討論

　　2. 1 色譜條件的優(yōu)化

　　2. 1. 1 檢測器的選擇

　　由于欲測定的樣品中蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的紫外吸收比較弱，且蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量較低，為了提高檢測的靈敏度，本文采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。以信噪比( S /N) 為指標(biāo)，分別對蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度和載氣壓力進行了優(yōu)化。結(jié)果在漂移管溫度55 ℃、載氣壓力0. 2 MPa ( 30 psi) 時，可以獲得最佳的信噪比。

　　2. 1. 2 流動相及洗脫程序的優(yōu)化

　　本文的前期研究工作發(fā)現(xiàn)，四君子丸提取物的組成復(fù)雜，干擾成分多，欲測定的各組分的保留因子范圍較寬，不適宜等度洗脫，因此選擇了梯度洗脫。流動相分別選擇甲醇-水( 含冰乙酸) 、甲醇-水( 含磷酸) 體系進行梯度洗脫試驗，相對來說，前者比后者的分離度好，靈敏度高。應(yīng)用不同梯度陡度( T) 的甲醇-水( 含冰乙酸) 體系進行試驗的結(jié)果表明，在0

　　- 40 min，甲醇的體積比從20% 升至80%，即T =0. 015 時，可在40 min 內(nèi)使所測定的組分分離。

　　為了考察冰乙酸的濃度對測定組分色譜行為的影響，在T = 0. 015 條件下，分別用0 ～ 1. 5% ( 體積分?jǐn)?shù)) 的冰乙酸進行梯度洗脫。結(jié)果表明，當(dāng)以甲醇和0. 5%冰乙酸水溶液為流動相時，各色譜峰的對稱性較好，峰形尖銳，且各峰與相鄰峰的分離度均大于1. 2，所以選擇了1. 4 節(jié)所述的流動相條件。

　　2. 2 系統(tǒng)的適用性

　　取供試品溶液10 μL 進樣，記錄色譜圖，黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的保留時間分別為7. 1，11. 6，17. 2，23. 4 和26. 5 min，各峰與相鄰峰的分離度均大于1. 2。供試品及對照品的色譜圖見圖1。

　　2. 3 方法學(xué)考察

　　2. 3. 1 線性方程、檢出限及精密度

　　將對照品儲備液稀釋成不同的濃度，按前述色譜條件測定峰面積，分別以各分析物色譜峰面積( Y) 的對數(shù)值為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度( X，g /L) 的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍( 見表1) 。取混合對照品儲備液不斷稀釋后進樣分析，以3 倍信噪比確定檢出限，結(jié)果

　　見表1。

　　取一定濃度的混合對照品溶液，分別進行峰面積和保留時間的日內(nèi)及日間測定的精密度( 以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD) 計) 考察。在同一天連續(xù)進樣6次，計算日內(nèi)精密度; 每份樣品連續(xù)測定6 d，計算日間精密度; 結(jié)果亦列于表1。表1 的結(jié)果表明，5種分析物峰面積和保留時間的RSD 均較小，表明方法的重復(fù)性良好。

　　按1. 3 節(jié)的方法平行制備6 份供試品，測定并計算5 種有效成分的含量，黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量的RSD 分別為2. 25%，1. 87%，1. 58%，1. 65%和1. 72%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

　　2. 3. 2 供試品溶液的穩(wěn)定性

　　取新制備的同一份供試品溶液，分別在室溫下放置0，1，2，4，8，12，24 h 后進樣分析。黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ峰面積的RSD 分別為1. 25%，1. 67%，1. 19%，1. 43%和1. 38%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

　　2. 3. 3 加標(biāo)回收率

　　精密稱取自制的丸劑12 份，分為4 組，每組3份。每組樣品中分別精密加入混合對照品儲備液0，20，50，100 μL，按所建立的方法進行供試品溶液的制備和測定，計算黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量，計算各組分的回收率，結(jié)果見表2。

　　表2 結(jié)果表明，所有組分的加標(biāo)回收率在97. 13% ～ 100. 25% 范圍內(nèi)，RSD 均小于2. 44%，說明本方法準(zhǔn)確可靠。

　　2. 4 樣品的測定

　　分別取5 個廠家生產(chǎn)的四君子丸，按1. 3 節(jié)的方法操作，取供試品溶液10 μL 進樣分析，并計算丸劑中5 種成分的含量，結(jié)果見表3。

　　3 結(jié)語

　　本文所建立的反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測梯度洗脫方法能夠準(zhǔn)確、靈敏地同時測定四君子丸中黨參炔苷、茯苓酸、甘草酸、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量，測定結(jié)果可靠，為四君子丸的質(zhì)量控制提供了簡單、有效的檢測手段。

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法，同時測定四君子丸中的5 種有效成分

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