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微波消解‐ICPMS測定動物血清和組織器官中的微量銀元素

摘要

銀的應用在當代生物醫(yī)學領域得到極大地推廣，其生物安全性也受到密關注，明確銀離子在生物體內(nèi)分布以及其安全閾值顯得格外重要。因此，需要一種高靈敏度的分析方法來確定醫(yī)學生物樣品中銀的含量。電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP‐MS)法對于金屬離子檢測具有很高的靈敏度，非常適用于醫(yī)學生物樣

品中所含痕量銀元素的檢測，但具體方法的開發(fā)，包括樣品前處理和檢測過程，尚處于起步階段。本研究建立了一套簡便易行的微波消解處理機體血清和組織器官樣品，通過ICP‐MS 法測定樣品內(nèi)微量銀元素的檢測方法。檢測結(jié)果表明ICP‐MS 方法可以準確地測定機體的微量銀元素，所建立的方法適用性強，可滿足不同類型醫(yī)學生物樣品中微量銀元素的測定，操作簡便快捷，結(jié)果準確且靈敏度高，尤其適合于大批量生物樣品的檢測，為其他生物樣品微量元素的檢測提供了指導。

關鍵詞

微波消解;ICP‐MS ;血清;組織;器官;銀

引　言

銀被公認具有廣譜抗菌活性，從古希臘人用銀來處理潰瘍促進傷口的愈合，到現(xiàn)代銀在紡織、化妝品、水質(zhì)消毒劑、傷口輔料和醫(yī)療器械等方面應用獲得極大地推廣。由于目前公開發(fā)表的動物實驗和人體接觸銀流行病學研究存在局

限性，銀對人體毒性反應沒有被明確，其生物安全性方面和人體吸收銀離子的潛在組織器官危害引起了熱議，明確銀在機體內(nèi)分布顯得尤為重要。

微量元素檢測常用的方法有原子吸收分光光度法(火焰與石墨爐) 、原子熒光法、極譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等。其中電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP‐MS)法具有靈敏度高、消耗樣品量少、檢測速度快、檢出限低、線性范圍寬、能同時測定多種元素的優(yōu)點，已越來越多地被應用于生物樣品分析中。ICP‐MS 由離子源和質(zhì)譜儀兩個主要部分構(gòu)成，樣品經(jīng)消解成溶液后，樣品溶液經(jīng)過霧化器由載氣送入ICP 炬焰中，經(jīng)過蒸發(fā)、解離、原子化、電離等過程，轉(zhuǎn)化為帶正電荷的離子，經(jīng)離子采集系統(tǒng)進入質(zhì)譜儀，質(zhì)譜儀根據(jù)質(zhì)荷比進行分離，對于一定質(zhì)荷比，質(zhì)譜積分面積與進入質(zhì)譜儀的離子數(shù)成正比，即樣品中元素濃度與質(zhì)譜的積分成正比，并與標準系列比較定量。

目前，國內(nèi)外對于醫(yī)學生物樣品經(jīng)處理后采用ICP‐MS檢測其中的銀元素的具體方法尚處于起步階段，本研究應用可降解含銀生物陶瓷修復兔股骨髁缺損，術(shù)后定期采集樣本，在總結(jié)前人工作的基礎上，詳細研究了ICP‐MS 法

　　測定動物血清和組織器官中的銀含量時樣品的前處理和檢測方法，該法簡便易行、快速準確、靈敏度高，尤其適合于大批量醫(yī)學生物樣品的檢測，對不同類樣品銀元素測定和同類樣品中其他元素的測定具有一定的指導意義。

1 　實驗部分

1.1 　儀器和試劑

ICP‐MS ，配有自動進樣器

微波消解儀

硝酸(69% ，質(zhì)量濃度)

過氧化氫(30% ，質(zhì)量濃度)

內(nèi)標原液(Y ) ：10mg · L - 1

銀標準貯備液：

超純水

高純氦氣(純度≥ 99.999% ) ;

液氬(純度≥ 99.999% ) 。

1.2 　樣品采集及處理

兔死后采集心臟、肝臟、脾臟和腎臟器官，以及內(nèi)植物周圍骨、肌肉和骨髓組織，以β‐磷酸三鈣植入組為空白對照。所有器皿及消化罐均須先以20% (φ)硝酸浸泡24 h ，然后用水反復沖洗，最后用超純水沖洗干凈。將樣品從冰箱取出，充分解凍。根據(jù)樣品性狀，血清樣品稱取1.0 g(精確至0.001 g) ，動物組織及器官樣品稱取0.5 ～ 1.0 g(精確至0.001 g) 。將樣品置于聚四氟乙烯消化罐中，加入5 mL 純硝酸浸泡1 h ，再加入2 mL H2 O2 ，蓋上密封蓋，放入微波消解儀中，微波消解儀功率和加熱時間調(diào)至

最佳程序(見表1) ，消解結(jié)束后，將聚四氟乙烯消解罐置于趕酸儀上，調(diào)節(jié)趕酸溫度至140 ℃ ，將酸液趕至0.5 mL 時停止趕酸，冷卻至室溫，加入2 mL 5% (φ)硝酸潤洗消解罐內(nèi)壁后，將消解液轉(zhuǎn)移至10 或25 mL 容量瓶中，用超純水沖洗消化罐內(nèi)壁3 次以上，合并至容量瓶中，用2% (φ)硝酸定容至刻度，混勻，待測。同時做試劑空白試驗。

1.3 　標準曲線制備

首先制備銀標準中間液(1.0 mg · L - 1 ) ，即吸取銀標準貯備液5.00 mL 于500 mL 容量瓶中，用5% (φ)硝酸溶液定容至刻度，此溶液每升含1 毫克銀。用移液槍移取銀標準中間液按表2 配制標準曲線溶液，使用時限為2 個星期，以2% (φ)稀硝酸為基體溶液。

1.4 　ICP‐MS 儀器工作參數(shù)

1.4.1 　質(zhì)譜調(diào)諧優(yōu)化

使用含1 μg · L - 1 Be ，Mg ，In ，Ce ，U質(zhì)譜調(diào)諧液優(yōu)化儀器工作條件，使儀器靈敏度、氧化物、雙電荷、背景等各項指標符合測定要求，儀器優(yōu)化調(diào)諧參數(shù)見

1.5.2 　儀器參數(shù)和測定方法

將不同濃度的標準曲線溶液分別進行測定，以內(nèi)標溶液在線混合進樣，記錄標準溶液與內(nèi)標溶液離子數(shù)比值，以它為縱坐標Y ，標準溶液濃度為橫坐標X ，繪制標準工作曲線，將樣品消解溶液注入電感耦合等離子體‐質(zhì)譜儀中，得到相應的信號響應值，根據(jù)標準曲線得到待測溶液中銀元素的濃度，平行測定次數(shù)為5 次。質(zhì)譜分析方法見表4 ，設定參數(shù)見表5 。

2 　結(jié)果與討論

2.1 　微波消解處理樣品

在采樣和制備過程中應注意不使樣品受到污染。HNO3 ‐H2 O2 能發(fā)生連鎖反應，增強硝酸的消解能力，能更徹底地破壞有機物，消解效果更佳。5 mL HNO3 和2 mL H2 O2 消解體系硝酸用量少，最終獲得的樣品消解溶液澄清透明;消解程序采用2000W 功率3 步式溫度梯度，樣品消解完全，獲

得的數(shù)據(jù)重復性好，且耗費時間短，為大批量樣品處理節(jié)省了時間。

2.2 　方法質(zhì)量控制

2.2.1 　銀元素相對原子質(zhì)量數(shù)的選擇及檢出限對于ICP‐MS 測定同位素相對原子質(zhì)量數(shù)的選擇，在避開同質(zhì)異位素和氧化還原物等多原子離子干擾的前提下，應盡可能選擇高豐度的同位素。在優(yōu)化儀器工作參數(shù)后，銀元素檢出限的測定是通過連續(xù)10 次測量空白溶液，然后以3 倍空白溶液的標準偏差除以線性相關

系數(shù)(標準曲線的斜率)作為儀器的檢出限。本方法確定銀的檢出限為0.98 μg · kg - 1 ，標準曲線相關系數(shù)為0.999 9 。

2.2.2 　方法的準確度試驗

為了評價方法的準確度，血清和組織器官樣品需做加標回收試驗。具體過程是將每個樣品等量分成2 份，1 份樣品的處理同前所述，另1 份在此基礎上加入含有被測銀元素的標準樣品，然后兩份樣品在相同條件下處理并測定。由表6可以看出，銀元素回收率為98% ～ 107% ，說明此方法對于血清和組織器官中微量銀元素的測定準確可靠。

2.2.3 　方法的精密度試驗

為了驗證方法的精密度，將同一樣品平均分為6 份，進行重復實驗，評估分析方法的精密度。相對標準偏差(RSD)是6 次測量結(jié)果的標準偏差與算術(shù)平均值的比值，反映了該方法檢測同一樣品的重現(xiàn)性。本方法檢測銀元素的RSD

介于2.0% ～ 4.3% 之間，方法精密度良好。

2.2.4 　樣品的穩(wěn)定性試驗

將6 份經(jīng)過測定之后的樣品消解溶液置于冰箱4 ℃ 保存，分別在其后1 ，4 ，7 天采用相同方法進行檢測并對結(jié)果統(tǒng)計分析，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示第1 ，4 和7天的測定值與首次測定值相一致，差異無統(tǒng)計學意義，表明銀元素在一周內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.3 　樣品測定結(jié)果

根據(jù)標準曲線，獲得如下公式，根據(jù)儀器讀值ρ 計算出樣品中銀的含量

　　式中：ω(Ag) ：樣品中銀的含量，mg· kg-1 ;

　　ρ ：測試溶液中銀的質(zhì)量濃度，μg · L-1 ;

　　V ：樣品定容體積，mL ;

　　f ：樣品稀釋倍數(shù);

　　m ：樣品取樣量，g 。

通過ICP‐MS 測定各時間點樣品(n = 5) ，發(fā)現(xiàn)植入β‐磷酸三鈣的空白對照組體內(nèi)均未檢出銀離子，可能與實驗動物日常飲食未攝入銀或者體內(nèi)銀含量太低達不到檢出限有關。植入載銀β‐磷酸三鈣的實驗組在各個時期均能檢測出銀離子含量，結(jié)果見表7 。檢測結(jié)果表明配制標準曲線時以稀硝酸作為基體液，而非以空白對照樣品消解液為基體液，是可行的，簡便易行。檢測結(jié)果顯示銀在體內(nèi)分布以肝臟最多，其次為脾臟，心臟內(nèi)最少，本工作結(jié)果可為今后研究銀系抗菌內(nèi)植物方面提供重要參考，其組織器官產(chǎn)生毒性反應的劑量將在另文討論。

結(jié)　論

在前人研究的基礎上建立了HNO3‐H2 O2 微波消解‐ICP‐MS 測定動物血清和組織器官中微量銀元素的分析方法，該法操作簡便快捷、結(jié)果準確可靠、靈敏度高、適用性強，可滿足不同類型醫(yī)學生物樣品中微量銀元素的測定，尤其適合大批量生物樣本檢測。機體攝入銀離子后，其濃度在全身各個組織器官的分布均不相同，主要以肝臟為靶器官，而銀在內(nèi)植物周圍局部組織分布相對均勻，且緩釋持久穩(wěn)定，為臨床骨感染的預防和治療提供了一種有效手段。

微波消解‐ICPMS測定動物血清和組織器官中的微量銀元素

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