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高效液相色譜法應用現(xiàn)狀與展望

　　摘要本文概述了高效液相色譜(HPLC)的系統(tǒng)組成、分類、工作原理及特點，并展望了高效液相色譜法的應用與發(fā)展前景。

　　關鍵詞流動相;液相色譜;色譜柱

　　Applications and prospects of high performance

　　liquid chromatography

　　1Wang Jun

　　(School of Chemstry and Chemcial Engeering,Guizhou University, Guiyang,550025)

　　Abstract This article provides an overview of the high performance liquid chromatography (HPLC) system, classification, working principles and characteristics, and looks forward to the prospect of the application and development of high-performance liquid chromatography.

　　Keywords mobile phase; liquid chromatography; column

　　引言

　　高效液相色譜分析(HPLC)是以高壓液體為流動相的液相色譜分析法，是 20世紀60年代末發(fā)展起來的一項新穎快速的分離分析色譜技術。它是在經(jīng)典的液體柱色譜法的基礎上，采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，引入氣相色譜理論后發(fā)展起來的。其基本方法是用高壓泵將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入裝有填充劑的色譜柱，經(jīng)進樣閥注入的樣品被流動相帶入色譜柱內(nèi)進行分離后依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號或進行數(shù)據(jù)處理而得到分析結果。HPLC 幾乎在所有學科領域都有廣泛應用，可以用于絕大多數(shù)物質(zhì)成分的分離分析。

　　1.高效液相色譜法概述

　　1.1儀器結構與原理[1]

　　HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng)，進行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。

　　其基本原理是用高壓泵將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入裝有填充劑的色譜柱，經(jīng)進樣閥注入的樣品被流動相帶入色譜柱內(nèi)進行分離后依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號或進行數(shù)據(jù)處理而得到分析結果。其基本組成如下圖所示：

　　1.2高效液相色譜分析的分類[2]

　　高效液相色譜法按分離機制的不同分為液-固吸附色譜法、液-液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法、體積排阻色譜法以及親和色譜法。

　　(1) 液-固吸附色譜法：使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上的分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度為5 µm～10 µm。適用于分離分子量為200～1000 的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構體。

　　(2) 液-液分配色譜法：使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。

　　(3) 離子交換色譜法：固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面末端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂) 或季氨基( 陰離子交換樹脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

　　(4) 離子對色譜法：又稱偶離子色譜法，是液-液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。

　　(5) 體積排阻色譜法：固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長;大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。

　　(6) 親和色譜法：將在不同基體上鍵合多種不同特性的配位體作為固定相，具有不同pH 的緩沖溶液作流動相，依據(jù)生物大分子(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核堿、核苷、核苷酸、核酸、酶等)與基體上鍵聯(lián)的配位體之間存在的特異性親和作用能力的差別，而實現(xiàn)對具有生物活性的生物分子的分離。

　　2.高效液相色譜法應用現(xiàn)狀

　　高效液相色譜分析(HPLC )幾乎在所有學科領域都有廣泛應用，可以用于絕大多數(shù)物質(zhì)成分的分離分析。

　　祁彥、占春瑞等[3]運用高效液相色譜法測定了大豆中13種三嗪類除草劑多殘留量。建立了同時檢測大豆中13種三嗪類除草劑多殘留量的反相高效液相色譜(RP- HPLC )方法。樣品經(jīng)乙腈提取，凝膠滲透色譜和中性氧化鋁SPE柱凈化，然后采用RP- HPLC二極管陣列檢測法測定，外標法定量。方法簡便、快速，凈化效果較好，可同時滿足進、出口大豆中多種除草劑殘留量的檢驗工作需要。

　　董雪玲、劉大錳等[4]運用高效液相色譜法測定大氣顆粒物中的雜環(huán)胺，建立了大氣顆粒物中雜環(huán)胺的高效液相色譜稔測方法。采用ODSC協(xié)色譜柱(250mm×4.6mm，5um)，乙腈~0.01mol/L三乙胺緩沖溶液液(pH4.0)為流動相，實現(xiàn)了6種雜環(huán)胺的基線分離和4種雜環(huán)胺的高靈敏度熒光檢測。

　　樊苑牧、俞雪鈞等[5]運用高效液相色譜法測定含脂羊毛中滅蠅胺和環(huán)蟲腈。建立了高效液相色譜法(HPLC)測定含脂羊毛中的滅蠅胺和環(huán)蟲腈的方法及HPLC-MS/MS確證方法。取得了良好的效果。

　　吳燕華、劉文力等[6] 運用高效液相色譜法測定蘋果中的酚類物質(zhì)。利用高效液相色譜法分析了紅星、秦冠、小國光、黃元帥和富士5個蘋果品種果皮和果肉中小分子酚類物質(zhì)的分布情況。色譜柱為C18柱，流動相為甲醇和水，在此色譜條件下，各組分均得到良好分離。

　　謝瑩、杭太俊等[7] 運用高效液相色譜法測定中藥中齊墩果酸和熊果酸含量。建立多種中藥中熊果酸與齊墩果酸含量測定方法，并確證兩種成分的存在形式，得出了可同時測定熊果酸與齊墩果酸含量，可用于藥材質(zhì)量控制的結論。

　　鄭屹、陳賽慧等[8] 運用高效液相色譜法檢測細胞能量代謝物質(zhì)。建立了高效液相色譜法(HPLC)測定細胞中ATP、ADP和AMP含量的方法，以比較高糖培養(yǎng)的MRC-5細胞和D-半乳糖誘導的擬衰老MRC-5細胞能量代謝水平。結果表明高效液相色譜法可檢測出不同狀態(tài)細胞能量物質(zhì)的差異，其具有操作簡便、快速、重現(xiàn)性好等特點，可以作為線粒體能量代謝功能的評估方法之一。

　　劉俊、吉曉佳等[9] 運用高效液相色譜法檢測植物組織中多胺含量。對反相高效液相色譜技術測定苯甲酰化多胺的方法進行了探討，確定和研究了苯甲�；磻淖罴褱囟�、時間和影響苯甲�；喟贩€(wěn)定性的因素，優(yōu)化了多胺的色譜分析條件。

　　曹淑瑞、劉治勇等[10]運用高效液相色譜法同時測定了食品中6種對羥基苯甲酸酯。建立了同時檢測食品中6種對羥基苯甲酸酯的高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)定量分析方法。樣品用乙腈提取，經(jīng)LC-C18固相萃取柱凈化，采用AgilentC18色譜柱分離，甲醇/水溶液梯度洗脫，二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。實驗效果良好。

　　3.高壓液相色譜的優(yōu)勢和不足

　　液相色譜法最大的特點是可以分離不可揮發(fā)或受熱后不穩(wěn)定的有機物，而且比氣相色譜流動相的選擇余地大。由于HPLC 的具有色譜柱可以反復使用，流動相可選擇范圍寬，流出組分容易收集，分離效率高，分析速度快，靈敏度高，操作自動化，適用范圍廣( 樣品不需氣化，只需制成溶液即可)，定量分析方法的準確度高的特點，在《中國藥典》中該法已成為中藥制劑含量測定最常用的分析方法。它與氣相色譜法配合使用，幾乎可以承擔絕大部分的有機物分離測試任務。高效液相色譜法總結起來有“四高一廣”的特點：

　　(1)高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

　　(2)高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時。

　　(3)高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

　　(4)高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng,進樣量在μL數(shù)量級。

　　(5)應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。

　　高壓液相色譜不足之處是定性能力較差。

　　4.應用前景展望

　　由于高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。與試樣預處理技術相配合，HPL C 所達到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。 HPL C可以成為解決生化分析問題最有前途的方法。HPL C具有的高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復利用，流出組分易收集等優(yōu)點，因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結構儀器的聯(lián)用是一個重要的發(fā)展方向。液相色譜-質(zhì)譜連用技術受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等; 液相色譜-紅外光譜連用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類、海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。

高效液相色譜法應用現(xiàn)狀與展望

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