液相色譜法測(cè)定豬和牛脂肪中孕酮?dú)埩袅?/h2>
液相色譜法測(cè)定豬和牛脂肪中孕酮?dú)埩袅?/p>
醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮為合成的孕激素類藥物，有明顯的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素對(duì)垂體促性腺激素的釋放有一定的抑制作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)惡心、頭暈、倦怠;(2)突破性出血;(3)孕期服用，會(huì)增加女性后代的男性化作用。孕激素類藥物能增強(qiáng)體內(nèi)物質(zhì)沉積和改善生產(chǎn)性能，可以很快產(chǎn)生顯著和直接的經(jīng)濟(jì)效益，因此，對(duì)生產(chǎn)者有很大的吸引力。畜牧業(yè)中使用孕激素類藥物(非治療用途)已有很長的歷史，但人類長期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦會(huì)明顯影響機(jī)體的激素平衡，而且有致癌危險(xiǎn)，對(duì)幼兒造成發(fā)育異常等危害。因此，開發(fā)一種能檢測(cè)孕酮?dú)埩袅康姆椒ㄊ鞘直匾�。本文采用高效液相色譜法對(duì)牛和豬脂肪樣品中的孕酮進(jìn)行檢測(cè).
1 試劑與儀器
1.1 試劑 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈，甲醇，乙酸乙酯，其他試劑為分析純。水由凈化系統(tǒng)制得。
(1)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1000μg/ml，分別準(zhǔn)確稱取0.05g 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)品于50ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。
(2)混合中間溶液I：100μg/ml，分別吸取10.0ml 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100ml 容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。
(3)混合中間溶液II：1.0μg/ml，取1.00ml 混合中間溶液I于100ml 容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用半年。
(4)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取10、20、40、80、100μl 混合中間溶液II 添加到980、970、950、910、890μl 的乙腈-水(65：35)中，再加入10μl 0.2%鹽酸溶液，混勻，得到濃度為0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml 和0.10μg/ml 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，供液相色譜測(cè)定，當(dāng)日使用。
1.2 儀器 LC7000 液相色譜系統(tǒng)，LC7011泵體，LC7020 紫外-可見檢測(cè)器，Hanon-Clarity色譜軟件。氮吹儀;海能全自動(dòng)固相萃取裝置;低溫離心機(jī);渦旋混勻器;CN 固相萃取柱。
2 測(cè)定步驟
2.1 試樣的制備與保存
2.1.1 試樣的制備 把大約5g 的豬或牛脂肪組織切成小塊，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml 的燒杯中，將燒杯置于微波爐內(nèi)。根據(jù)所熬制脂肪量，使用最大功率，加熱30 ～60s，如果脂肪沒有融化，可在間隔30 ～60s 以后重復(fù)加熱30 ～60s，直到有液體脂肪流出，通過漏斗滴入燒杯中。把熬制好的脂肪油放入樣品瓶中，密封，并做上標(biāo)記。
2.1.2 樣品的保存 把熬制好的脂肪油樣品置于-18℃中，冷凍保存.
2.2 提取 稱取熬制好的脂肪油2.00 ±0.01g，置于50ml具塞離心管中，加入5ml 乙腈，于60℃水浴中保溫3min 以使固體脂肪溶化，渦旋振搖1min，在-5℃下離心7min(離心力1160g)，吸取上清液至15ml 帶塞聚丙烯離心管，再在沉淀物中加入5ml 乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2 ×2ml 正己烷，渦旋振搖1min，于-5℃中離心5min(離心力1160g)，棄去正己烷層。乙腈提取液于60℃中用氮吹儀吹干，殘?jiān)砘?/P>
2.3 皂化 在殘?jiān)?2.2 項(xiàng))中依次加入4ml 正己烷、1ml0.1mol/L 氫氧化鈉溶液和0.5ml 1.0mol/L 氯化鎂溶液，于渦旋混勻器上快速混勻10s，在60℃水浴中保溫15min，于-5℃中離心5min(離心力1160g)，吸取上清液至15ml玻璃試管。在沉淀物中再加入4ml 正己烷混勻后，在60℃水浴中加熱15min 后， 在-5℃ 中離心5min (離心力1160g)，合并上清液。于60℃中用氮?dú)獯蹈蓛x吹干，用1.0ml 正己烷溶解殘?jiān)�，待凈化�?/P>
2.4 凈化 將皂化后的樣液(2.3 項(xiàng))倒入經(jīng)5ml 乙酸乙酯和6ml 正己烷預(yù)處理過的CN 柱中，用2 ×1ml 正己烷潤洗玻璃試管，洗液倒入到CN 柱中。待樣液流過后，依次用5ml 正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，隨后打開真空泵將小柱中液體抽干，保持抽氣2min。最后用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脫，洗脫液收集于15ml 玻璃試管中，于60℃中用氮?dú)獯蹈蓛x吹干。殘余物用990μl 乙腈-水(65：35) 渦旋溶解，靜止15min 后，加入
10μl 0.2%鹽酸溶液，混勻，供液相色譜測(cè)定。
2.5 測(cè)定
2.5.1 液相色譜條件 色譜柱：C18 柱(250mm ×4.6mm，5μm);預(yù)柱：C18 柱(12.5mm ×4.6mm，5μm);流動(dòng)相：乙腈-水(65：35);流速：1暢0ml/min;柱溫：35℃;檢測(cè)波長：292nm;進(jìn)樣量：40μl。
2.5.2 液相色譜測(cè)定 根據(jù)樣液中3 種孕酮的含量情況，選定濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液中3 種孕酮的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。
圖1 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色譜圖(100 ng/ml)
1 -醋酸甲地孕酮，2 -醋酸氯地孕酮，3 -醋酸美侖孕酮
3 結(jié)果與討論
3.1 線性范圍 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮濃度在0.010 ～0.10μg/ml 范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)(γ2 )均大于0.998。
3.2 回收率、精密度和定量檢測(cè)限 本實(shí)驗(yàn)以2 種脂肪(牛脂肪和豬脂肪)作為樣本。取適量標(biāo)準(zhǔn)品加入到2.0g樣品中，使添加量相當(dāng)于10、20 和50μg/kg，每個(gè)添加水平各取24 份試樣(每種脂肪各12 份)。圖2 為空白脂肪樣品和添加樣品(10μg/kg)的色譜圖。表1 為醋酸美侖孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外標(biāo)法測(cè)得的室內(nèi)回收率和精確度。表2 為8 家實(shí)驗(yàn)室的室間回收率和精確度結(jié)果。根據(jù)回收率試驗(yàn)，能可靠測(cè)得的最低濃度確定定量檢測(cè)限(LOQ)，LOQ 為10μg/kg，滿足殘留限量的檢測(cè)要求。
(A)
(B)
(C)
(D)
圖2 空白脂肪樣品和添加樣品(10(g/kg)的色譜圖
A：牛脂肪空白樣;B：豬脂肪空白樣;C：牛脂肪添加樣;D：豬脂肪添加樣
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