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食品、多維片和飲料中12 種維生素的高效液相色譜法同時測定

　　維生素是一類性質(zhì)各異的低分子量天然有機化合物，具有不同的生理功能、分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，在生物體的生命活動中具有十分重要的作用，與人體的生長發(fā)育和健康密切相關;維生素的種類很多，按其溶解性可分為水溶性維生素和脂溶性維生素。目前維生素的測定方法主要有紫外光度法[1]、熒光光度法[2]、氣相色譜法[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4～7]和高效毛細管電泳法[8，9]等。HPLC 不僅操作簡便，重現(xiàn)性好，而且其溫和的操作條件對于穩(wěn)定性差的維生素也可得到準確的定量結(jié)果; 但在多數(shù)應用HPLC 法對維生素進行測定的文獻中只是對其中一類維生素中的幾種進行測定，對水溶性、脂溶性維生素進行同時測定的文獻報道極少。本研究建立了反相高效液相色譜法同時測定了8 種水溶性維生素和4 種脂溶性維生素的方法，并應用于實際樣品中測定，取得了較為滿意的結(jié)果。

　　1 材料與方法

　　1.1 主要儀器與試劑

　　海能LC7000高效液相色譜儀; 色譜柱(C18， 5 μm， 4.6 ×250 mm) ;。甲醇(色譜純)、鹽酸(優(yōu)級純)、乙醇(分析純)、無水乙醚(分析純)、氫氧化鉀(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)，其他試劑除指明外均為分析純。維生素標準品： VC、VB1、VB2、VB6、VB12、煙酸、葉酸、VD3、VE 標準品; 煙酰胺標準品; VK1 標準品所; VA (視黃醇) 標準品。

　　維生素標準儲備液：分別稱取維生素A、D3、E、K1的標準貯備液(1 mg / ml，乙醇配制)， -18℃避光保存; VB1、VB2、VB6、VB12、煙酸、煙酰胺標準貯備液(1 mg / ml， 0.01 mol / LHCl 配制); 葉酸標準貯備液(1 mg / ml， 200 μl 5 mol / L KOH溶解后，再用0.01 mol / L HCl 定容); VC 臨用新配(1 mg / ml，0.01 mol / L HCl 配制); 儲備液均儲于-18℃冰箱中。臨用新配維生素標準應用液。

　　實驗用水為Millipore 超純水(18.2 MΩ·cm)。脂溶性維生素A 和E 應用液濃度在測定前標定[10]。

　　本實驗中的多維片、強化米粉、玉米粉和飲料樣品均購自超市。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 色譜條件流動相： A： 0.05 mol / L KH2PO4溶液(pH 6.0); B：甲醇; 色譜線性梯度洗脫程序; 柱溫： 40℃。見表1。

　　1.2.2 標準曲線的繪制根據(jù)不同樣品中維生素的含量范圍，用標準儲備液配制不同濃度的混合標準液，在高效液相色譜儀基線達平直后，進行測定并繪制標準曲線; 維生素混合標準色譜圖見圖1。

　　注： 1. 維生素C (VC， 3.0 min); 2. 煙酸(Niacin， 5.3 min); 3.維生素B1 (VB1， 6.3 min); 4. 維生素B6 (VB6， 6.7 min); 5. 煙酰胺(Nicotinamide， 7.4 min); 6. 葉酸(Folic acid， 7.8 min); 7. 維生素B12(VB12， 11.0 min); 8. 維生素B2 (VB2， 12.9 min); 9. 維生素A (VA，18.7 min); 10. 維生素D3 (VD3， 21.1 min); 11. 維生素E (VE， 21.7min); 12. 維生素K1 (VK1， 24.9 min)。

　　圖1 12 種維生素混合標準樣品色譜圖

　　1.2.3 樣品處理復合維生素片劑、米粉準確稱取0.2 g 碾磨混勻的樣品于15 ml 離心管內(nèi)，加入10 ml 0.01 mol / L HCl，超聲提取15 min 后12 000 r / min 離心5 min，取上清液作為待測液A; 再準確稱取樣品(碾磨均勻的復合維生素片0.7 g 或米粉4 g) 于250 ml 三角瓶中，加入20 ml 乙醇，超聲提取15min，加入50%的KOH 溶液(復合維生素片劑5 ml; 米粉10ml)， 90℃皂化30 min，皂化液用100 ml 乙醚萃取并于40℃水浴旋蒸至干， 5 ml 乙醇定容，此為待測液B; 將同種樣品的A液與B 液以體積比9︰1 混合作為測試液， 20 μl 進樣分析; 樣品色譜圖見圖2、3。

　　飲料取一定量經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后， 20 μl 進樣分析。樣品色譜圖見圖4。

　　1.2.4 樣品測定與結(jié)果計算在標準溶液測定相同條件下，對樣液進行測定。以保留時間定性，讀取各維生素峰面積。通過回歸方程、樣品稱樣量和提取液體積計算樣品中各種維生素的含量(mg / kg)。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 色譜條件的優(yōu)化

　　2.1.1 梯度洗脫條件的優(yōu)化在文獻[11]的基礎上，選擇甲醇和磷酸二氫鉀緩沖液為流動相; 因等度洗脫分離困難，采用梯度洗脫方式。根據(jù)12 種維生素色譜峰形、分離度和色譜分析時間，最終確定兩種溶劑組成比例及梯度洗脫程序見表1。

　　2.1.2 流動相中緩沖液pH 值的選擇由于維生素的性質(zhì)差別較大，流動相pH 值對其色譜分離有重要影響; 緩沖液pH 值為4.0～8.0 時，至少有2 種維生素出峰時間發(fā)生重合; 當pH為6.0 時， 12 種維生素能夠完全分離。

　　2.1.3 柱溫的選擇實驗表明，當柱溫為30℃～40℃時，各維生素峰面積最大，但是在30℃時， VB1和VB6、煙酰胺和葉酸不能完全分離，且有峰展寬現(xiàn)象; 柱溫為40℃時， VB1和VB6、煙酰胺和葉酸達到完全分離且峰形較好; 溫度50℃時，VC 峰面積明顯變小，且VB1和VB6、煙酰胺和葉酸峰重合;因此，選擇40℃為色譜分離柱箱溫度。

　　2.1.4 流速的選擇流動相固定后，流速的選擇會影響色譜分離，由于水溶性、脂溶性維生素性質(zhì)不同，因此在分析過程中選擇了不同的流速見表1。

　　2.1.5 檢測波長的選擇8 種水溶性維生素的最大吸收波長相近(見表2)，由于VB1與VB6、煙酸與葉酸的峰分離時間間隔較短，難以完成波長切換，為確保方法靈敏度，將VB1、VB6、煙酰胺、葉酸的檢測波長都設為266 nm; 其余均為其最大吸收波長。檢測波長切換程序見表3。